【導(dǎo)讀】流式細(xì)胞術(shù)被臨床醫(yī)生和診斷醫(yī)生廣泛用于分析細(xì)胞特性。他們用光學(xué)方法逐一評(píng)估每個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量、血液健康狀況、粒度和細(xì)胞大小等屬性。盡管系統(tǒng)靈敏度高，但流式細(xì)胞儀的設(shè)計(jì)人員一直面臨著需要加速分析的壓力，這就要求采用新的方法設(shè)計(jì)流式細(xì)胞術(shù)及其相關(guān)電子元件。
本文將簡(jiǎn)要介紹流式細(xì)胞術(shù)系統(tǒng)的工作原理。然后介紹 Analog Devices 的 18 位 ADC 模塊 ADAQ23878，并展示如何利用該模塊來(lái)設(shè)計(jì)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)和轉(zhuǎn)換階段。此外，本文還將介紹一個(gè)可用于評(píng)估流式細(xì)胞術(shù)前端設(shè)計(jì)的評(píng)估套件。希望通過(guò)本文，讀者能夠更好地了解流式細(xì)胞術(shù)的高效數(shù)據(jù)采集解決方案。
流式細(xì)胞術(shù)被臨床醫(yī)生和診斷醫(yī)生廣泛用于分析細(xì)胞特性。他們用光學(xué)方法逐一評(píng)估每個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量、血液健康狀況、粒度和細(xì)胞大小等屬性。盡管系統(tǒng)靈敏度高，但流式細(xì)胞儀的設(shè)計(jì)人員一直面臨著需要加速分析的壓力，這就要求采用新的方法設(shè)計(jì)流式細(xì)胞術(shù)及其相關(guān)電子元件。
流式細(xì)胞儀對(duì)各個(gè)細(xì)胞進(jìn)行激光照射，產(chǎn)生散射和熒光信號(hào)。為了快速、準(zhǔn)確地捕捉所產(chǎn)生的光線并將其轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，需要一個(gè)雪崩光電二極管 (APD) 和復(fù)雜的電子元件。要設(shè)計(jì)和實(shí)現(xiàn)這個(gè)過(guò)程的電路可能需要很長(zhǎng)時(shí)間，特別是考慮到流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)需要高速、低噪音的設(shè)備來(lái)確保系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。
為了實(shí)現(xiàn)更快的流式細(xì)胞術(shù)分析并保證成本效益，設(shè)計(jì)人員可以通過(guò)由內(nèi)部放大器驅(qū)動(dòng)器和模數(shù)轉(zhuǎn)換器 (ADC) 組成的數(shù)據(jù)采集解決方案解決速度和準(zhǔn)確性問(wèn)題。
現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)原理
現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)是一個(gè)自動(dòng)化過(guò)程，可以分析細(xì)胞和表面分子，描述并定義異質(zhì)細(xì)胞群中的不同細(xì)胞類型。不算準(zhǔn)備時(shí)間（可能超過(guò)一個(gè)小時(shí)），該儀器能在不到一分鐘的時(shí)間里對(duì) 10000 個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行三到六個(gè)特征評(píng)估。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，流式細(xì)胞術(shù)的單細(xì)胞制備步驟至關(guān)重要。樣品在鞘液中組織，以流體力學(xué)方式將細(xì)胞或顆粒聚焦到狹長(zhǎng)的單細(xì)胞列樣品流中，以進(jìn)行分析。在經(jīng)過(guò)這種轉(zhuǎn)換后，單細(xì)胞必須保持其自然的生物特征和生化成分。圖 1 是流式細(xì)胞術(shù)儀的示意圖，首先從頂部加入多細(xì)胞樣品。
圖 1：流式細(xì)胞儀示意圖，從鞘液聚焦到數(shù)據(jù)采集。（圖片來(lái)源：Wikipedia，由 Bonnie Baker 修改）
流式細(xì)胞儀包含六個(gè)主要組件：流通池、激光器、雪崩光電二極管 (APD)、跨阻放大器 (TIA)、ADC，以及用于數(shù)據(jù)收集和分析的計(jì)算機(jī)。流式細(xì)胞儀有液流或鞘液，這兩者會(huì)收窄，以將細(xì)胞排列成單列送過(guò)光束。激光每次捕獲一個(gè)細(xì)胞，產(chǎn)生前向角散射光 (FSC) 信號(hào)和側(cè)向角散射光 (SSC) 信號(hào)。熒光通過(guò)鏡子和過(guò)濾器進(jìn)行分類，然后由 APD 進(jìn)行放大。接下來(lái)，在產(chǎn)生的光輸出擊中 APD 后對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)、數(shù)字化和分析。對(duì)于檢測(cè)來(lái)說(shuō)，Analog Devices 的 LTC6268 500 兆赫 (MHz) 超低偏置電流、低電壓噪聲 FET 輸入運(yùn)算放大器對(duì)于檢測(cè)所需的高速 TIA 是理想選擇。
圖 2：TIA 電路使用一個(gè) APD (PD1) 和一個(gè)低輸入電流的 FET 運(yùn)算放大器，將超低的光電二極管電流轉(zhuǎn)換成 IN1+ 的輸出電壓。（圖片來(lái)源：Bonnie Baker）
設(shè)計(jì)此放大器電路時(shí)，必須盡可能地?cái)U(kuò)大帶寬，因而必須盡量減少寄生電容。例如，寄生反饋電容 C 影響了圖 2 的電路穩(wěn)定性和帶寬。無(wú)論選擇何種電阻器封裝，在放大器的反饋路徑中總會(huì)存在寄生電容。但是，0805 封裝端蓋間距較長(zhǎng)，寄生電容最低，是高速應(yīng)用的首選。增加 R1 端蓋之間的距離并不是減少電容的唯一方法。另一種減少板對(duì)板電容的方法是在電阻 R1 下增設(shè)一條接地線，來(lái)屏蔽產(chǎn)生寄生電容的電場(chǎng)路徑（圖 3）。
圖 3：在反饋電阻下增設(shè)接地線，可從反饋端分流電場(chǎng)，并將傾泄至地面。（圖片來(lái)源：Analog Devices）
在這種情況下，該方法具體涉及到在靠近 TIA 輸出端的電阻墊下面和之間放置一條短的接地線。此方法可讓寄生電容達(dá)到 0.028皮法拉 (pF)，TIA 帶寬達(dá)到 1/(2π*RF*CPARASITIC)，相當(dāng)于 11.4 MHz。光信號(hào)會(huì)導(dǎo)向幾個(gè)帶有適當(dāng)濾光片的雪崩二極管。APD、TIA 和 ADC 系統(tǒng)將這些信號(hào)轉(zhuǎn)換為其數(shù)字表示，并將數(shù)據(jù)發(fā)送到微處理器做進(jìn)一步分析。現(xiàn)代細(xì)胞儀通常配備多個(gè)激光器和 APD。目前的商用設(shè)備有 10 個(gè)激光器和 30 個(gè)雪崩光電二極管。增加激光和光電倍增管檢測(cè)器的數(shù)量，可以進(jìn)行多次抗體標(biāo)記，從而通過(guò)表型標(biāo)記精確識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞群。不過(guò)，分析速度還是取決于以下因素的微妙平衡：
流式細(xì)胞術(shù)聲波聚焦
雖然增加多個(gè)激光器和 APD 可以加速分析和識(shí)別，但在最好的情況下，最新的現(xiàn)代單細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)每分鐘可以收集多達(dá)一百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)。在許多應(yīng)用中，如檢測(cè)血液中低至每毫升 100 個(gè)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞時(shí)，這種處理遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。在罕見(jiàn)細(xì)胞的臨床應(yīng)用中，試驗(yàn)經(jīng)常需要對(duì)數(shù)十億的細(xì)胞進(jìn)行分析，非常耗時(shí)。聲波聚焦過(guò)程是流體力學(xué)聚焦細(xì)胞制備過(guò)程的替代方案。在該過(guò)程中，將一種壓電材料（如鋯鈦酸鉛 (PZT)）附著在玻璃毛細(xì)管上，使電脈沖轉(zhuǎn)換成機(jī)械振動(dòng)（圖 4a）。通過(guò)使用 PZT 在矩形流通池的共振頻率下振動(dòng)玻璃毛細(xì)管的側(cè)壁，系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生具有不同數(shù)量壓力節(jié)點(diǎn)的各種聲駐波。
圖 4：矩形玻璃毛細(xì)管制成的聲學(xué)流通池示意圖 (a)。定寬毛細(xì)管的前三個(gè)壓力節(jié)點(diǎn)的位置 (b)。（圖片來(lái)源：美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心）
這些 PZT 頻率節(jié)點(diǎn)將流動(dòng)的粒子排列成多條離散的流線（圖 4b）。聲學(xué)流通池使用線性聲駐波，通過(guò)產(chǎn)生單次或多次諧波來(lái)調(diào)諧為各種波長(zhǎng)。正如簡(jiǎn)單線性駐波模型所預(yù)測(cè)的那樣，樣品中的細(xì)胞在流通池中產(chǎn)生單個(gè)或多個(gè)單細(xì)胞列。借助這種精確的細(xì)胞組織，鞘液隧道的寬度可以擴(kuò)大，以加速流過(guò)激光束（圖 5）。
圖 5：對(duì)于流體力學(xué)樣品流（c.和 d.），隨著鞘液寬度增加，細(xì)胞樣品發(fā)生散射，使光學(xué)測(cè)量過(guò)程變得困難。無(wú)論鞘液寬度如何，聲波聚焦的樣品流（a.和 b.）都保持單列細(xì)胞。（圖片來(lái)源：Thermo Fischer Scientific）
傳統(tǒng)的流體力學(xué)聚焦（圖 5c.）將單細(xì)胞排成列，準(zhǔn)備進(jìn)行激光掃描。雖然樣品流核心的漏斗越寬，鞘液材料的速度就越快（圖 5d.），但這也會(huì)導(dǎo)致單細(xì)胞列發(fā)生分散，從而產(chǎn)生信號(hào)變化并影響數(shù)據(jù)質(zhì)量。聲波聚焦（圖5a.）將生物細(xì)胞和其他顆粒緊密地排列在一起，即使隧道較寬也沒(méi)有問(wèn)題。這種精確的細(xì)胞排列允許更高的采樣率，同時(shí)保持?jǐn)?shù)據(jù)質(zhì)量（圖 5b.）。在實(shí)踐中，流式細(xì)胞術(shù)聲波聚焦可使細(xì)胞采樣頻率提高約 20 倍（圖 6）。
圖 6：基于流體流式細(xì)胞術(shù)（A、B、C）與聲波聚焦細(xì)胞術(shù) (D) 對(duì)比的各種流式細(xì)胞術(shù)設(shè)備采樣時(shí)間比較。（圖片來(lái)源：Thermo Fischer Scientific）
在圖 6 中，A、B 和 C 的設(shè)備采用流體力學(xué)技術(shù)，而 D 則采用聲波聚焦流式細(xì)胞術(shù)方法。
聲波聚焦流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)采集
聲波聚焦流式細(xì)胞術(shù)設(shè)備的電子元件設(shè)計(jì)需要高速光敏電子元件，以適應(yīng)血液細(xì)胞和鞘液通過(guò)較大直徑噴嘴的速度。前面提到的 600 MHz 高速 LTC6268 與專門的 0805 電阻封裝布局相結(jié)合，使光感應(yīng)速率高達(dá) 11.4 MHz（圖 7 左）。LTC6268 的輸出被送入Analog Devices ADAQ23878 ADC 進(jìn)行數(shù)字化。
圖 7：ADAQ23878 ADC 將光電二極管 (PD1) 和 TIA 電路（左）的光信號(hào)數(shù)字化。（圖片來(lái)源：Bonnie Baker）
ADAQ23878 是一款 18 位、每秒 15 兆次采樣 (MSPS) 的精密高速系統(tǒng)級(jí)封裝 (SIP) 數(shù)據(jù)采集解決方案。它將設(shè)計(jì)人員所面對(duì)的輸入驅(qū)動(dòng)元器件選擇、優(yōu)化和布局等設(shè)計(jì)挑戰(zhàn)轉(zhuǎn)移至設(shè)備，從而極大地縮短了精密測(cè)量系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)周期。
這種 SIP 的模塊化方法通過(guò)將多個(gè)通用信號(hào)處理和調(diào)節(jié)模塊與高速、18 位、15 MSPS 逐次逼近寄存器 (SAR) ADC 組合在一個(gè)設(shè)備中，減少了終端系統(tǒng)的元器件數(shù)量。這些模塊包含一個(gè)低噪聲、全差分 ADC 激勵(lì)放大器和一個(gè)穩(wěn)定的參考緩沖器。
ADAQ23878 還集成了關(guān)鍵的無(wú)源元器件，它們采用 Analog Devices 的iPassive 技術(shù)，可最大限度地減少與溫度有關(guān)的誤差源并優(yōu)化性能。ADC 快速建立的驅(qū)動(dòng)級(jí)有助于其確保快速數(shù)據(jù)采集。
評(píng)估 ADAQ23878 μModule為了評(píng)估 ADAQ23878，Analog Devices 提供了 EVAL-ADAQ23878FMCZ 評(píng)估板（圖 8）。該評(píng)估板可展示 ADAQ23878 μModule 的性能，是用于評(píng)估流式細(xì)胞術(shù)前端設(shè)計(jì)和其他各種應(yīng)用的一款多功能工具。
圖 8：用于 ADAQ23878 的 EVAL-ADAQ23878FMCZ 評(píng)估板板載電路，配備用于控制和數(shù)據(jù)分析的關(guān)聯(lián)軟件，并且兼容 SDP-H1。（圖片來(lái)源：Analog Devices）
EVAL-ADAQ23878FMCZ 評(píng)估板需要一臺(tái)運(yùn)行 Windows 10 或更高版本的個(gè)人計(jì)算機(jī)、一個(gè)低噪聲的精密信號(hào)源以及一個(gè)適合 18位測(cè)試的帶通濾波器。該評(píng)估板需要 ADAQ23878 ACE 插件和 SPD-H1 驅(qū)動(dòng)器。
雖然使用標(biāo)準(zhǔn)的流體力學(xué)聚焦流式細(xì)胞術(shù)逐一檢查生物細(xì)胞已取得成功，但由于需要加快分析速度，人們開(kāi)始轉(zhuǎn)而改用以聲波聚焦流式為主的方法。因此，若要支持更先進(jìn)的流式細(xì)胞術(shù)，電子元件也必須改進(jìn)，同時(shí)盡量縮小空間、節(jié)約成本并縮短開(kāi)發(fā)時(shí)間。如本文所述，LTC6268 高速運(yùn)算放大器可與 ADAQ233878 精密、高速、μModule 數(shù)據(jù)采集解決方案相結(jié)合，為先進(jìn)的流式細(xì)胞術(shù)設(shè)備建立完整的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，從而保證快速的數(shù)據(jù)采集。
(作者：Bonnie Baker，來(lái)源：DigiKey得捷）
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